В недавнем исследовании, опубликованном в Science Advances, исследователи использовали общеорганный подход для количественного анализа количества клеток, размера и регуляции идентичности при адаптации тканей средней кишки дрозофилы к питательным веществам.

Общие сведения

Кишечник взрослого человека — это регионализированный орган, который изменяет размер и состав в зависимости от доступности пищи, контролируя пролиферацию и дифференцировку кишечных стволовых клеток (ISC). Потребление питательных веществ влияет на физиологию взрослых животных, изменяя клеточный состав органов за счет активации соматических стволовых клеток. Питание существенно влияет на объем и форму тонкой кишки, позволяя адаптировать сигнальные, всасывающие и метаболические функции к физиологическим потребностям животных. Средняя кишка дрозофилы имеет четыре уникальных типа клеток, которые все отличаются от ISC. Размер средней кишки сильно варьируется в зависимости от диеты.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи изучили влияние пищевой сигнализации на решения о судьбе клеток во взрослом кишечнике, в частности на регуляцию пролиферации и дифференцировки стволовых клеток кишечника (ISC).

В исследовании использовались мухи, которых содержали при температуре 25 ° C в среде, содержащей различные питательные вещества, используя диету холидик в качестве экспериментального рациона. Они препарировали ткани кишечника, которые фиксировали, промывали, блокировали и окрашивали антителами. Они провели диссекцию кишечника и диссоциацию клеток с флуоресцентными антителами (FACS), сортировку клеток роста 1 (G1) и G2 в буфер для выделения рибонуклеиновой кислоты (РНК) в трех дублированных образцах по 80-100 кишок в каждом. Они выделили и амплифицировали РНК, создали и секвенировали библиотеки, а также сфотографировали иммуноокрашенную серединку кишечника с помощью конфокальных микроскопов.

Исследователи использовали линейный анализ средней кишки (LAM) для оценки регуляции роста стволовых клеток кишечника (ISC) у мух. Они оценили максимальную площадь поперечного сечения ядра в средней кишке голодающих и накормленных мух и использовали маркер ISC Delta-lacZ для изучения регуляции размера, вызванной питанием. Они также исследовали участие сигнального пути mTORC1, признанного регулятора размера клеток, путем измерения уровней p4EBP в областях R1, R2, R4 и R5. Они снизили активность mTORC1 посредством нокдауна Raptor RNAi и оценили площадь ядра в ISC.

Исследователи исследовали функцию и контроль активности mTORC1 в клетках трансформирующего фактора роста (TGF). Они использовали Дельта-Gal4 для экспрессии репортера индикатора клеточного цикла на основе флуоресцентного убиквитинирования (FUCCI), что позволило им изучить фосфорилирование 4EBP на различных стадиях роста. Они также проанализировали экспрессию генов на различных фазах развития, выдвинув гипотезу, что размер клеток может быть связан с дифференцировкой ISC.

Команда также исследовала связь между сигнальной активностью кишечных стволовых клеток mTORC1 и дельта-экспрессией путем оценки региональной интенсивности дельта-lacZ у крыс натощак и на корме. Они также исследовали, активно ли mTORC1 ингибирует дифференцировку клеток ЭЭ. Они сравнили кишечник пожилых мух, которых кормили ad libitum диетически, с кишечником тех, кто подвергался пожизненному периодическому голоданию.

Результаты

У мух специфическая для региона модуляция размера, количества и дифференцировки клеток характеризует адаптацию кишечника к питанию. Мишень рапамицинового комплекса 1 млекопитающих (mTORC1) стимулирует рост стволовых клеток кишечника (ISC), усиливает дельта-экспрессию и направляет судьбу клеток к линии поглощающих энтеробластов. У старых мух передача сигналов ISC mTORC1 нерегулируема и нечувствительна к пище, что может быть снижено путем пожизненного периодического голодания. Сигналы, индуцируемые питательными веществами, по-разному регулируют развитие энтероцитов (ЭК) и дифференцировку ISC в разных регионах.

Исследование выявило региональные различия в адаптивном развитии средней кишки, при этом переход от быстрого состояния к питанию увеличивает пролиферацию ISC и рост EC, что позволяет динамично регулировать размер средней кишки взрослого человека. Современное понимание контроля роста средней кишки основано на локальных количественных оценках конкретных локализаций, без глобального понимания всего органа. Питание вызывает уникальные изменения в дочерних клетках ISC, энтероэндокринных (EE) клетках и нейробластах (EBS), при этом специфичная для региона активация mTORC1 определяет рост ISC. Географическое распределение роста ISC согласуется с накоплением EB во время кормления.

Полученные результаты показали, что активация ISC mTORC1 связана с парами клеток ISC-EB асимметричного типа, которые быстро пролиферируют во время дифференцировки в EC. ISC также могут развиваться в крошечные диплоидные EE-клетки, контролируемые сигнализацией Notch. Большие ISC коррелируют с дифференцировкой EB. Передача сигналов ISC mTORC1 увеличивает дельта-экспрессию, которая зависит от региона и рациона питания. Крупные ISC с высокой активностью mTORC1 экспрессируют большое количество Дельта, которые направляют дифференцировку на судьбу EB специфичным для региона образом.

Высокая передача сигналов mTORC1 влияет на судьбу клеток EE. Нокдаун Raptor в клонах Notch LOF уничтожил кластеры Prospero− p4EBP +, сделав их однородными для клеток Prospero +. Периодическое голодание защищает от вызванного старением снижения адаптации кишечника к питанию, подразумевая, что физиологически зависящий от питания контроль передачи сигналов mTORC1 утрачивается у старых ISC, но сохраняется у мух, получающих прерывистое голодание.

Заключение

В целом, результаты исследования показали, что передача сигналов mTORC1 имеет решающее значение для судьбы стволовых клеток кишечника (ISC) в ответ на диету. Он демонстрирует региональные различия в развитии энтероцитов, количестве клеток и распределении клеток по типам при переходе от голодания к полноценному питанию. Животные, которых кормили, активируют пути восприятия питательных веществ mTORC1 в ISC или ECs в зависимости от региона. Стволовые клетки толстого кишечника с высокой активностью mTORC1 проявляют дельта-лиганд Notch в больших количествах, способствуя дифференцировке в линии поглощения.